Aktif Bölge Mimarisinin Anlaşılması Temelinde, NAD + Bağımlı Mutant Candida methylica Format Dehidrogenaz Enziminin Spesifik Aktivitesinin Arttırılması

Abstract

Format dehidrogenaz enzimi (FDH), endüstriyel biyokatalizörler arasında son yıllarda en çok dikkat çeken enzimlerden biridir. Özellikle NAD(P)+ bağımlı FDH, gerçekleştirdiği reaksiyonun düşük redoks potansiyeli nedeniyle biyoenerji üretimi ve saf kiral bileşiklerin sentezi sırasında ihtiyaç duyulan sürekli NAD(P)H yenilenmesinin sağlanması için en çok başvurulan enzimlerdendir. Endüstriyel biyoteknoloji için, NAD(P)+ bağımlı FDH’ın en büyük dezavantajı mevcut FDH’ların (FDHs) düşük aktiviteye sahip olmasıdır. Bu nedenle özellikle endüstriyel ölçekte biyokatalitik yöntemlerle değerli farmasötik saf kiral ara bileşiklerin sentezi için gerekli olan sürekli NAD(P)H’nin yenilenmesinde FDH enziminin kullanılması oldukça yüksek maliyetlidir. Proje başvurusu öncesinde ön çalışma olarak literatürde rapor edilen ısıl kararlılığı arttırılmış Candida methylica (Cm) mutant FDH’ın yapısı analiz edilmiştir. Bunun için, öncelikle Cm FDH’ın homoloji yöntemi ile yapısı tahmin edilmiş ve elde edilen yapı moleküler dinamik ile optimize edilmiştir. Sonra diğer kaynaklardan elde edilen FDH enzimlerin dizileri ve yapıları ile karşılaştırılarak; Cm FDH için katalitik bölgeyi oluşturan, formik asit-NAD+ bağlanma bölgesini oluşturan amino asit pozisyonları tahmin edilmiştir. Enzimin aktif bölgesini oluşturduğu yada katalitik aktivitesinde etkili olabileceği tahmin edilen Thr67, Phe69, Gly92, Val93, Gly94, Asp96, Arg258, Gln287, His311 dokuz (9) amino asit, ISM yönteminin CAST tekniği için aday amino asit pozisyonları olarak belirlenmiştir. Projenin kabulu sonrası ilk iş olarak, hesapsal yöntemler ve literatür bilgisi ile belirlenen fonksiyonel amino asit pozisyonları için ISM/CAST ile mutant kütüphanesi oluşturulmuştur. Petri platelerde oluşturulan her mutant kütüphanesi için 20-50 arasında koloni elde edilmiştir. Oluşturulan mutant kütüphaneleri, substrat olarak NAD+ ve formik asite karşı yüksek spesifik aktiviteye sahip mutant FDH’ı seçmek için taranmıştır. Tarama sonucu 13 tane mutant koloninin aktif olduğu gözlemlenmiştir. Seçilen substratlara karşı doğal tip Cm FDH ile karşılaştırıldığında spesifik aktivitesi yüksek olan mutant FDH’lar seçilerek, dizi ananlizi için dizilemeye gönderilmiştir. Dizileme sonucu aktif olan 13 mutanttan sadece 3 tanesinde baz değişimi olduğu görülmüştür. Bunlardan 2 tanesinde sessiz mutasyon, diğerinde ise N119R değişimi tespit edilmiştir. TAGZyme sistemi ile saflaştırılmış ve yabanıl tip ve mutant enzimin kinetik değerleri sırasıyla format ve NAD+’ye karşı KM 11,20 ve 0,95 mM, kcat 22,21 ve 54,56 s-1 olarak belirlenmiştir. Büyük yan zincirden kaynaklı substratlara ev sahipliği yapan 119. pozisyon için yerinin daha az su ile dolması ve substratlar ile daha çok etkileşmesi seçilen substratlar için KM değerinde iyileşmeye neden olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca, Arg119’a ait geniş hacimli yan zinciriyle His311’e hidrit transferinin kolaylaşması kcat’in artmasına yol açtığı düşünülmektedir. vii Son olarak elde edilen mutant FDH enziminin substrat ile olan etkileşimleri, moleküler dinamik simülasyonuyla elde edilen yapıda incelenmiştir. Modelleme çalışmaları sonuçları göstermektedir ki; Arg119 mutasyonu iki monomerin birleşme noktasında olan Phe69 üzerinden yapısal değişikliklere yol açmaktadır. Bu mutasyonun, NAD+ ile bağlanmayı güçlendiren etkilere sahip olduğu iyileşen kinetik değerlerden dolayı da tahmin edilmektedir. Elde edilen yapı göstermektedir ki; arjinin sahip olduğu uzun yan zincir ile substratların doğru yönde yönlendirilmesini, hidrit iyonunun formik asitten His311’e daha hızlı transfer olmasını sağlamakta ve iyileşen KM ve kcat değerleri bu varsayımları desteklemektedir. Proje sonunda; NAD+ ve formata karşı yaklaşık %10 katalitik aktivitesi arttırılmış, karakterize edilmiş, ısıya dayanıklı mutant FDH enzimi tanımlanmıştır. 119. pozisyondaki Asn, Arg ile yer değiştirmesi, substratların katalitik bölgeye daha iyi yönelmesini sağlamıştır. Arg, Asn gibi karboksilat grubu üzerinden substratları koordine etmiştir. Yüksek katma değerli endüstriyel biyokatalizör olarak aktivitesi yüksek olan mutant FDH enziminin patentlenmesi planmaktadır.