https://hdl.handle.net/20.500.12294/217 Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümüne ait diğer yayınlar bu koleksiyonda listelenir. Sat, 08 Aug 2026 00:16:36 GMT 2026-08-08T00:16:36Z https://hdl.handle.net/20.500.12294/3912 Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics Usman, Sani Sharif; Uba, Abdullahi Ibrahim; Christina, Evangeline Bacteriophages (phages) are viruses that mainly infect bacteria and are ubiquitously distributed in nature, especially to their host. Phage engineering involves nucleic acids manipulation of phage genome for antimicrobial activity directed against pathogens through the applications of molecular biology techniques such as synthetic biology methods, homologous recombination, CRISPY-BRED and CRISPY-BRIP recombineering, rebooting phage-based engineering, and targeted nucleases including CRISPR/Cas9, zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Management of bacteria is widely achieved using antibiotics whose mechanism of action has been shown to target both the genetic dogma and the metabolism of pathogens. However, the overuse of antibiotics has caused the emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria which account for nearly 5 million deaths as of 2019 thereby posing threats to the public health sector, particularly by 2050. Lytic phages have drawn attention as a strong alternative to antibiotics owing to the promising efficacy and safety of phage therapy in various models in vivo and human studies. Therefore, harnessing phage genome engineering methods, particularly CRISPR/Cas9 to overcome the limitations such as phage narrow host range, phage resistance or any potential eukaryotic immune response for phage-based enzymes/proteins therapy may designate phage therapy as a strong alternative to antibiotics for combatting bacterial antimicrobial resistance (AMR). Here, the current trends and progress in phage genome engineering techniques and phage therapy are reviewed. Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/20.500.12294/3912 2023-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/20.500.12294/3853 İnsan p60-katanin Proteininin, Bitki RIC1 ve İnsan Homoloğu Kiaa1432 Proteinleri ile Etkileşiminin Tespiti & Etkileşimin Mikrotubuller Üzerinde Fonksiyonel Analizi Korulu, Şirin Koç; Selçuk, İlke; Kurtoğlu, Ceren Mikrotubuller ihtiyaç durumuna göre uzayıp–kısalabilen, yeniden organize olabilen dinamik yapılı polimerlerdir. Mikrotubul organizasyonu, bölünen hücrelerde mitoz, post-mitotik nöronlarda akson/dendrit yapılarının oluşumunda görevlidir. Mikrotubul organizasyonuna imkan sağlayan mekanizmalardan birisi Katanin gibi mikrotubul kesici proteinlerce kesilmeleridir. Katanin, KATNA1 geni tarafından kodlanan ve enzimatik aktiviteye sahip p60, onun fonksiyonunu düzenleyen ve KATNB1 geni tarafından kodlanan p80 alt birimlerinde oluşmaktadır. Katanin’in bilinen regülatörleri, etkileşim partnerleri yok denecek kadar azdır. Arabidopsis thaliana bitkisinde yapılan çalışmalarda p60-katanin’in bir GTPase olan RIC1 proteini ile etkileştiği ve p60-katanin’in enzimatik aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçtan hareketle, önerilen proje ile insan p60-katanin proteininin, bitki RIC1 ve insan homoloğu Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşiminin tespiti ve etkileşimin mikrotubul kesimi bakımından fonksiyonel açıdan aydınlatılması amaçlanmıştır. Proteinlerin etkileşim bakımından incelenebilmesi adına ilk olarak bu proteinleri kodlayan cDNA’lar FLAG ve His eki içeren plazmidlere ayrı ayrı klonlanmışlardır. Arabidopsis thaliana p60-katanin ve RIC1 proteinleri Prof. Ying Fu tarafından temin edilmiş olup sadece ilgili plazmidlere aktarılmışlardır. İnsan p60-katanin yürürlükte olan 114Z971 projesi kapsamında FLAG ekli olarak elde edilmiş olup insan Kiaa1432 proteinini kodlayan cDNA klonlanmıştır. Klonlamayı takiben proteinler fiziksel etkileşim bakımından ko-immün çöktürme yöntemiyle test edilmiştir. Son olarak, His ve FLAG ekli olarak klonlanan proteinlerin cDNA’larını içeren plazmidler farklı kombinasyonlar halinde hücreye verilmek suretiyle olası etkileşimin mikrotubul ağına etkisi araştırılmıştır. Yapılan analizlerin sonucunda insan p60-katanin’in Arabidopsis thaliana RIC1 ve bu proteinin insan homoloğu Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşimine rastlanamamıştır. Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/20.500.12294/3853 2023-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/20.500.12294/3852 Aktif Bölge Mimarisinin Anlaşılması Temelinde, NAD + Bağımlı Mutant Candida methylica Format Dehidrogenaz Enziminin Spesifik Aktivitesinin Arttırılması Binay, Barış; Torun, Soner Format dehidrogenaz enzimi (FDH), endüstriyel biyokatalizörler arasında son yıllarda en çok dikkat çeken enzimlerden biridir. Özellikle NAD(P)+ bağımlı FDH, gerçekleştirdiği reaksiyonun düşük redoks potansiyeli nedeniyle biyoenerji üretimi ve saf kiral bileşiklerin sentezi sırasında ihtiyaç duyulan sürekli NAD(P)H yenilenmesinin sağlanması için en çok başvurulan enzimlerdendir. Endüstriyel biyoteknoloji için, NAD(P)+ bağımlı FDH’ın en büyük dezavantajı mevcut FDH’ların (FDHs) düşük aktiviteye sahip olmasıdır. Bu nedenle özellikle endüstriyel ölçekte biyokatalitik yöntemlerle değerli farmasötik saf kiral ara bileşiklerin sentezi için gerekli olan sürekli NAD(P)H’nin yenilenmesinde FDH enziminin kullanılması oldukça yüksek maliyetlidir. Proje başvurusu öncesinde ön çalışma olarak literatürde rapor edilen ısıl kararlılığı arttırılmış Candida methylica (Cm) mutant FDH’ın yapısı analiz edilmiştir. Bunun için, öncelikle Cm FDH’ın homoloji yöntemi ile yapısı tahmin edilmiş ve elde edilen yapı moleküler dinamik ile optimize edilmiştir. Sonra diğer kaynaklardan elde edilen FDH enzimlerin dizileri ve yapıları ile karşılaştırılarak; Cm FDH için katalitik bölgeyi oluşturan, formik asit-NAD+ bağlanma bölgesini oluşturan amino asit pozisyonları tahmin edilmiştir. Enzimin aktif bölgesini oluşturduğu yada katalitik aktivitesinde etkili olabileceği tahmin edilen Thr67, Phe69, Gly92, Val93, Gly94, Asp96, Arg258, Gln287, His311 dokuz (9) amino asit, ISM yönteminin CAST tekniği için aday amino asit pozisyonları olarak belirlenmiştir. Projenin kabulu sonrası ilk iş olarak, hesapsal yöntemler ve literatür bilgisi ile belirlenen fonksiyonel amino asit pozisyonları için ISM/CAST ile mutant kütüphanesi oluşturulmuştur. Petri platelerde oluşturulan her mutant kütüphanesi için 20-50 arasında koloni elde edilmiştir. Oluşturulan mutant kütüphaneleri, substrat olarak NAD+ ve formik asite karşı yüksek spesifik aktiviteye sahip mutant FDH’ı seçmek için taranmıştır. Tarama sonucu 13 tane mutant koloninin aktif olduğu gözlemlenmiştir. Seçilen substratlara karşı doğal tip Cm FDH ile karşılaştırıldığında spesifik aktivitesi yüksek olan mutant FDH’lar seçilerek, dizi ananlizi için dizilemeye gönderilmiştir. Dizileme sonucu aktif olan 13 mutanttan sadece 3 tanesinde baz değişimi olduğu görülmüştür. Bunlardan 2 tanesinde sessiz mutasyon, diğerinde ise N119R değişimi tespit edilmiştir. TAGZyme sistemi ile saflaştırılmış ve yabanıl tip ve mutant enzimin kinetik değerleri sırasıyla format ve NAD+’ye karşı KM 11,20 ve 0,95 mM, kcat 22,21 ve 54,56 s-1 olarak belirlenmiştir. Büyük yan zincirden kaynaklı substratlara ev sahipliği yapan 119. pozisyon için yerinin daha az su ile dolması ve substratlar ile daha çok etkileşmesi seçilen substratlar için KM değerinde iyileşmeye neden olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca, Arg119’a ait geniş hacimli yan zinciriyle His311’e hidrit transferinin kolaylaşması kcat’in artmasına yol açtığı düşünülmektedir. vii Son olarak elde edilen mutant FDH enziminin substrat ile olan etkileşimleri, moleküler dinamik simülasyonuyla elde edilen yapıda incelenmiştir. Modelleme çalışmaları sonuçları göstermektedir ki; Arg119 mutasyonu iki monomerin birleşme noktasında olan Phe69 üzerinden yapısal değişikliklere yol açmaktadır. Bu mutasyonun, NAD+ ile bağlanmayı güçlendiren etkilere sahip olduğu iyileşen kinetik değerlerden dolayı da tahmin edilmektedir. Elde edilen yapı göstermektedir ki; arjinin sahip olduğu uzun yan zincir ile substratların doğru yönde yönlendirilmesini, hidrit iyonunun formik asitten His311’e daha hızlı transfer olmasını sağlamakta ve iyileşen KM ve kcat değerleri bu varsayımları desteklemektedir. Proje sonunda; NAD+ ve formata karşı yaklaşık %10 katalitik aktivitesi arttırılmış, karakterize edilmiş, ısıya dayanıklı mutant FDH enzimi tanımlanmıştır. 119. pozisyondaki Asn, Arg ile yer değiştirmesi, substratların katalitik bölgeye daha iyi yönelmesini sağlamıştır. Arg, Asn gibi karboksilat grubu üzerinden substratları koordine etmiştir. Yüksek katma değerli endüstriyel biyokatalizör olarak aktivitesi yüksek olan mutant FDH enziminin patentlenmesi planmaktadır. Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/20.500.12294/3852 2023-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/20.500.12294/3071 Gene therapy in haemophilia: literature review and regional perspectives for Turkey Kavakli, Kaan; Antmen, Bulent; Okan, Vahap; Sahin, Fahri; Aytac, Selin; Balkan, Can; Berber, Ergul; Kaya, Zuhre; Kupesiz, Alphan; Zulfikar, Bulent Haemophilia is an X-linked lifelong congenital bleeding disorder that is caused by insufficient levels of factor VIII (FVIII; haemophilia A) or factor IX (FIX; haemophilia B) and characterized by spontaneous and trauma-related bleeding episodes. The cornerstone of the treatment, factor replacement, constitutes several difficulties, including frequent injections due to the short half-life of recombinant factors, intravenous administration and the risk of inhibitor development. While extended half-life factors and subcutaneous novel molecules enhanced the quality of life, initial successes with gene therapy offer a significant hope for cure. Although adeno-associated viral (AAV)-based gene therapy is one of the most emerging approaches for treatment of haemophilia, there are still challenges in vector immunogenicity, potency and efficacy, genotoxicity and persistence. As the approval for the first gene therapy product is coming closer, eligibility criteria for patient selection, multidisciplinary approach for optimal delivery and follow-up and development of new pricing policies and reimbursement models should be concerned. Therefore, this review addresses the unmet needs of current haemophilia treatment and explains the rationale and principles of gene therapy. Limitations and challenges are discussed from a global and national perspective and recommendations are provided to adopt the gene therapies faster and more sufficient for the haemophilia patients in developing countries like Turkey. © The Author(s), 2022. Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/20.500.12294/3071 2022-01-01T00:00:00Z